Le tandem dCas9–dCpf1 offre un réglage chirurgical des voies d’intérêt, pour tirer parti des réseaux métaboliques de la levure. Cette approche permet une régulation transcriptionnelle fine des gènes cibles, sans cassure chromosomique ni perte d’intégrité génomique.
Vous ajustez l’expression à la demande pour réduire les flux vers des sous-produits et soutenir la formation de molécules d’intérêt. Ce système privilégie l’activation ou la répression ciblée, plutôt qu’une édition génomique programmée classique, pour des gains mesurables en bioproduction levurienne de composés à haute valeur, sans détour.
Que signifie l’association dCas9–dCpf1 pour un contrôle fin des gènes ?
L’association de dCas9 et de dCpf1 crée deux canaux orthogonaux pour piloter la transcription dans une même souche, sans rupture de l’ADN. Ces nucléases sont des effecteurs catalytiquement inactifs, capables d’acheminer des modules vers promoteurs et enhancers. Pour visualiser l’apport, voici des atouts concrets :
- PAM distincts et complémentaires (NGG, TTTV).
- Compatibilité avec des multiplexages de gRNA.
Cette synergie élargit la palette de réglages.
Le positionnement des gRNA conditionne la réponse transcriptionnelle et le niveau de régulation. Sur un même locus, dCas9 met en place une interférence CRISPRi qui gêne l’initiation transcriptionnelle, tandis que dCpf1 favorise une activation CRISPRa via le recrutement d’activateurs positionnés en amont; l’expression devient réversible, dose-dépendante et sensible au site, sans altération de la séquence.
Saccharomyces cerevisiae en production biotechnologique, atouts et limites
Adoptée par les brasseries et la chimie verte, S. cerevisiae s’intègre aux procédés, de la fiole au bioréacteur. Sa biologie annotée, ses promoteurs modulables et les banques de mutants accélèrent la conception de souches productrices. Les ingénieurs réorientent les flux carbone au sein des voies métaboliques fermentaires pour maximiser formation d’éthanol, d’arômes, ou de précurseurs de médicaments.
Des verrous persistent quand la pression monte : chaleur, osmolalité, acides organiques.
À retenir : le génome de 12 Mb et près de 6 000 gènes offrent un terrain d’ingénierie très documenté.
L’amélioration de la tolérance aux solvants, du transport des métabolites et de l’équilibre redox soutient des rendements en bioréacteur plus élevés, tout en conservant la stabilité génétique sur de longues cultures.
Comment ajuster l’expression sans couper l’ADN avec dCas9 et dCpf1 ?
Les variants catalytiquement inactifs de Cas9 et de Cpf1 contrôlent l’expression en recrutant des domaines régulateurs, sans créer de cassure double brin. Dans S. cerevisiae, la précision dépend de la distance au TSS et de la fenêtre de ciblage, ce qui autorise une modulation de promoteurs graduée et réversible.
Positionner un guide sur le site d’initiation réduit la transcription en gênant Pol II. C’est le principe du CRISPRi, où dCas9 ou dCpf1 provoquent un blocage d’initiation transcriptionnelle; à l’inverse, des effecteurs comme VPR ou p65 atténuent cette inhibition et transforment le système en CRISPRa.
Ciblages multiplexés et librairies de gRNA au service de voies métaboliques complexes
Pour optimiser des voies étagées, cibler plusieurs gènes en parallèle apporte une synergie nette. Vous assemblez des panneaux de guides compatibles, en travaillant la conception de gRNA avec règles de PAM, tout en déployant des architectures multigéniques qui coordonnent dCas9 et dCpf1 sur des modules communs.
Les arrays CRISPR sont construits sur une chaîne unique, puis ribozymes ou tRNA libèrent chaque guide au bon dosage. Par l’assemblage Golden Gate, vous itérez rapidement, et vous pilotez l’équilibrage de flux métabolique pour limiter les goulots, réduire les sous-produits et stabiliser la production ciblée.
| Paramètre (S. cerevisiae) | dCas9 (SpCas9) | dCpf1 (Cas12a: As/Lb) |
|---|---|---|
| PAM | NGG | TTTV |
| Longueur du guide | ~20 nt (sgRNA) | ~24 nt (crRNA) |
| Structure de l’ARN guide | sgRNA (crRNA + tracrRNA fusionnés) | crRNA seul (pas de tracrRNA) |
| Multiplex natif | via tRNA ou ribozymes (HH/HDV) pour découpe | arrays de crRNA auto-traités par Cas12a |
| Promoteurs RNAP III courants | SNR52, RPR1 | SNR52, RPR1 |
| Applications en contrôle | CRISPRi/CRISPRa par recrutement d’effeteurs | CRISPRi/CRISPRa, orthogonal au Cas9 |
Quels gains de titres et de rendements ont été observés ?
Les combinaisons dCas9–dCpf1 modulent précisément des voies chez S. cerevisiae, ce qui se traduit par des gains mesurables en fermentation. Dans plusieurs études pilotes, des réglages d’activation et de répression ont augmenté les titres du produit final sans accroître les sous‑produits. Les campagnes en cuves pilotes montrent aussi une hausse de la productivité volumique lorsque l’équilibre NAD(P)H est maintenu.
Des exemples représentatifs incluent des terpènes, des alcools supérieurs et l’acide succinique, avec une meilleure orientation des flux et moins de pertes de carbone. Sur des séries de souches isogéniques, une analyse comparative a confirmé une baisse des inhibitions par métabolites et une stabilité accrue des profils. Voici des indicateurs suivis par les équipes de fermentation.
- Rendement massique sur substrat (g/g).
- Productivité horaire (g/L·h) et taux spécifique (g/gCDW·h).
- Sélectivité du carbone vers la molécule cible.
- Robustesse des titres au fil des passages.
Sécurité génétique et traçabilité des souches en milieu industriel
Les souches d’ingénierie reposant sur dCas9 et dCpf1 inactifs évitent les cassures double brin et limitent les réarrangements imprévus. En production, le confinement génétique s’appuie sur des verrous aux nutriments, des circuits d’arrêt et des dépendances à des inducteurs qui ne se trouvent pas hors de l’usine. L’objectif est de réduire la persistance et d’empêcher les transferts horizontaux.
La traçabilité repose sur une identification fiable des lignées et une documentation précise des lots. Des signatures génétiques via barcoding chromosomique facilitent l’attribution des échantillons et la détection d’écarts. La surveillance hors cible combine séquençage profond, qPCR et contrôles phénotypiques pour repérer des événements non souhaités. Ces pratiques soutiennent la conformité réglementaire et la libération des batches.
À noter : l’utilisation de dCas9 et dCpf1 inactifs limite les cassures double brin, ce qui abaisse le risque de réarrangements et accélère la qualification sous GMP.
Mise en œuvre en routine fermentaire, du design à la validation
Pour la routine fermentaire, vous intégrez le duo dCas9–dCpf1 au cycle design–build–test des ateliers de levure. Les cibles, les PAM et les promoteurs sont priorisés par algorithmes, via une conception in silico rigoureuse, puis assemblés avec Yeast Toolkit ou Golden Gate. La modularité permet de basculer d’activation à répression sans toucher l’ADN.
Au laboratoire pilote, l’expression est ajustée par gradients de glucose, température et pH, en microfermentations et en bioréacteurs. Les bibliothèques de gRNA sont évaluées par un criblage à haute cadence, reliant phénotypes, flux et sous-produits pour sélectionner les combinaisons gagnantes. Les profils sont confirmés par une validation omics intégrée, combinant RNA‑seq, qPCR, métabolomique et HPLC pour quantifier titres, productivités et robustesse.